何首烏為蓼科何首烏屬植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，味苦、甘、澀，性微溫。生品具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效，炮制后味轉甘厚而性轉溫，增強了補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂等功效[1]，故臨床多以制品應用[2]。近年來(lái)有關(guān)何首烏不良反應事件頻發(fā)[2-4]，其中以肝毒性為主，由此引發(fā)了對何首烏臨床安全用藥的廣泛關(guān)注。《中國藥典》2020年版收載的制何首烏炮制方法中對于炮制終點(diǎn)的規定仍采用性狀描述，即“燉至汁液吸盡；或蒸至內外均呈棕褐色”，缺少客觀(guān)化的評判標準，易造成飲片炮制程度不一，品質(zhì)參差不齊等問(wèn)題，可能成為影響臨床療效并引發(fā)臨床不良反應的重要因素之一[5]。本課題組對何首烏古今炮制方法進(jìn)行了梳理，發(fā)現九蒸九曬是古代何首烏的經(jīng)典炮制方法，始載于宋代《太平圣惠方》[6]，并作為主流炮制方法沿用至清代，其中《本草綱目》記載的“用何首烏赤白各一斤，竹刀刮去粗皮，米泔浸一夜，切片，用黑豆三斗，每次用三升三合三勺，以水泡過(guò)，砂鍋內鋪豆一層，首烏一層，重重鋪盡，蒸之，豆熟，取出去豆，將何首烏曬干，再以豆蒸，如此九蒸九曬，乃用”[7]，應用較為廣泛，后因炮制方法繁瑣，無(wú)法滿(mǎn)足現代化工業(yè)生產(chǎn)的需求而逐漸被無(wú)需反復蒸曬的現代炮制方法取代。但古籍記載何首烏炮制時(shí)曾有“（何首烏）制非九次，勿寢其毒”之說(shuō)[8]，提示反復炮制減毒作用更強。同時(shí)，現代研究也表明，九蒸九曬法對何首烏減毒效果最好，與藥典法炮制的何首烏相比，對肝細胞生長(cháng)的抑制率更低、損傷更小[9-10]。因此，九蒸九曬炮制方法不僅具有其合理性，也為解決何首烏臨床用藥安全性問(wèn)題提供了新的途徑。 目前，部分學(xué)者對九蒸九曬制首烏飲片進(jìn)行了相關(guān)研究，采用譜學(xué)技術(shù)對其化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，并對其進(jìn)行了肝毒性評價(jià)[11-12]，但現有研究中記載的九蒸九曬方法多受現代方法影響，采用液體輔料（黑豆汁）蒸/燉的方式，而非古代文獻記載的固體輔料（黑豆）蒸/燉[7]，其炮制方法的復原有一定偏差性。同時(shí)，現有研究多注重于對飲片內在物質(zhì)的分析，而忽略了傳統性狀在其工藝制訂和質(zhì)量評價(jià)中的作用。顏色作為中藥飲片最直觀(guān)的性狀特征，不僅是其質(zhì)量評價(jià)的重要指標之一，也是炮制工藝重點(diǎn)控制的主要參數[13-14]。何首烏飲片經(jīng)炮制后顏色加深，主觀(guān)描述難以準確反映其顏色變化，電子眼作為一種基于模擬人體感官而出現的人工智能感官技術(shù)，可以客觀(guān)表征飲片顏色，尤其能準確區分不同炮制方法飲片間的微小色差，兼具圖像采集、數字圖像處理和結果反饋功能[15]，目前已廣泛應用于中藥飲片的顏色測定與質(zhì)量評價(jià)[16-18]。為了追本溯源，本實(shí)驗將遵循古代文獻記載方法制備九蒸九曬制何首烏飲片，與《中國藥典》2020年版收載的炮制方法進(jìn)行比較，通過(guò)主要化學(xué)成分的定量分析、基于智能感官分析技術(shù)的顏色客觀(guān)表征，以及二者的相關(guān)性分析，探討制何首烏古今炮制方法的差異性。為進(jìn)一步規范何首烏飲片炮制工藝，穩定制何首烏飲片質(zhì)量，提高其臨床應用安全性奠定基礎。 1 材料 LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；VA400型IRIS視覺(jué)分析儀，含CMOS鏡頭、顏色校準板與Alpha Soft 14.3數據分析軟件，法國Alpha M.O.S公司；FA2204B型電子天平，萬(wàn)分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司；XSR105DU型電子分析天平，十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZN-08L小型高速粉碎機，中科耐馳技術(shù)（北京）有限公司；KQ-100DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。 何首烏藥材購自四川宜賓，黑豆藥材購自甘肅，經(jīng)中國中醫科學(xué)院中藥研究所肖永慶研究員鑒定為蓼科何首烏屬植物何首烏P. multiflorum Thunb.的干燥塊根和豆科大豆屬植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟種子；何首烏委托河北百草康神藥業(yè)有限公司按照《中國藥典》2020年版何首烏項下方法加工為生品（標記為HSW）。 對照品沒(méi)食子酸（批號wkq21090111）、大黃 素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號wkq21060404），質(zhì)量分數均≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；對照品5-羥甲基糠醛（批號20090201）、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（以下簡(jiǎn)稱(chēng)二苯乙烯苷，批號19070305）、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號20120702），質(zhì)量分數均≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；對照品大黃素，批號D- 029-190713，質(zhì)量分數≥98%，北京融城鑫德科技發(fā)展有限公司；對照品大黃素甲醚，批號PS0291- 0020，質(zhì)量分數＞98.5%，成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。 2 方法與結果 2.1何首烏不同飲片的制備 2.1.1 九蒸九曬何首烏飲片 取黑豆10.8 kg，加1.2倍水浸泡12 h。取生何首烏飲片約3.6 kg，拌入泡黑豆的水悶潤至水被吸盡，與浸泡后的黑豆間隔鋪放至燉制容器中，燉制4 h（電磁爐1800 W、圓氣計時(shí)），棄去黑豆，取出何首烏飲片，平鋪攤開(kāi)晾干，作為一蒸一曬何首烏飲片，再加入新的黑豆（浸泡12 h）重復上述操作，反復9次，得到九蒸九曬何首烏飲片。平行制備3份（標記為ZSSW9-1～3）。 2.1.2 藥典法制何首烏飲片 參照《中國藥典》2020年版一部制何首烏項下黑豆汁燉法制備，取生何首烏飲片約1 kg，加黑豆汁拌勻，燉至汁液吸盡，取出，自然晾曬至干燥后，得到藥典法制何首烏飲片。平行制備3份（標記為ZSW-1～3）。 黑豆汁制法：取黑豆300 g，加水適量，煮約4 h，熬汁約450 g，豆渣再加水煮約3 h，熬汁約300 g，合并得黑豆汁約750 g。 2.2 何首烏不同飲片中7個(gè)成分的含量測定 2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%～25%乙腈；20～26 min，25%～35%乙腈；26～30 min，35%～50%乙腈；30～35 min，50%～70%乙腈；35～45 min，70%～90%乙腈；45～50 min，90%乙腈；檢測波長(cháng)280 nm；體積流量1.00 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。此條件下所測各成分能夠較好分離，色譜圖見(jiàn)圖1。
2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱(chēng)定沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚對照品各適量，分別加80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為57.6、68.4、625.0、50.2、8.6、180.0、0.216 μg/mL的對照品溶液，即得。 2.2.3 供試品溶液的制備 取何首烏飲片粉末（過(guò)40目篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，密塞，再稱(chēng)定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。 2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線(xiàn)，并計算得到回歸方程與線(xiàn)性范圍，結果分別為沒(méi)食子酸Y＝28 655.693 5 X－3 449.895 2，R2＝1.000 0，線(xiàn)性范圍5.76～144.00 mg/L；5-羥甲基糠醛Y＝78 294.955 3 X＋11 679.404 8，R2＝1.000 0，線(xiàn)性范圍6.84～171.00 mg/L；二苯乙烯苷Y＝16 640.258 1 X＋12 599.471 0，R2＝0.999 9，線(xiàn)性范圍62.50～1 562.50 mg/L；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷Y＝30 743.247 5 X－9 558.630 6，R2＝0.999 9，線(xiàn)性范圍5.02～125.50 mg/L；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷Y＝27 693.578 4 X－241.880 6，R2＝1.000 0，線(xiàn)性范圍0.86～21.50 mg/L；大黃素Y＝34 965.433 1 X－22 341.082 3，R2＝0.999 9，線(xiàn)性范圍18.00～450.00 mg/L；大黃素甲醚Y＝37 991.286 3 X＋8 456.727 4，R2＝1.000 0，線(xiàn)性范圍21.60～540.00 mg/L；結果表明，各對照品在各自范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好。 2.2.5 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（ZSW-1）10 μL，重復進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件測定，6次測定結果顯示，沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.17%、0.39%、0.31%、0.54%、1.64%、0.21%、0.63%，表明儀器精密度良好。 2.2.6 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液（ZSW-1）10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣共6次，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.52%、0.82%、0.36%、1.38%、1.54%、0.39%、0.90%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定。 2.2.7 重復性試驗 取制何首烏粉末（ZSW-1）約1 g，精密稱(chēng)定，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算各成分含量，結果沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚含量的RSD分別為0.33%、0.92%、0.08%、1.65%、1.67%、1.59%、1.90%，表明該方法重復性良好。 2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱(chēng)定已測定指標成分含量的何首烏粉末（ZSW-1）約0.5 g，共6份，置平底燒瓶中，分別加入對照品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取上述樣品與對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為98.88%、97.99%、97.32%、102.85%、108.12%、96.67%、99.33%，RSD分別為0.36%、0.74%、0.33%、0.74%、0.93%、0.43%、1.16%，均符合《中國藥典》2020年版規定標準。 2.2.9 樣品測定 分別稱(chēng)取生何首烏、九蒸九曬何首烏、藥典法制何首烏飲片適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，每個(gè)樣品平行2次，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算各成分含量，結果見(jiàn)表1。含量測定結果表明，何首烏不同飲片中均含有沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚6種成分，但不同飲片間各成分含量存在一定差異。九蒸九曬、藥典法制何首烏中沒(méi)食子酸及蒽醌苷元類(lèi)成分的含量與生何首烏相比，均有不同程度的增加，其中以沒(méi)食子酸含量增加最為顯著(zhù)，藥典法制何首烏約為生品的3倍，九蒸九曬何首烏約為生品的2倍。炮制為制何首烏后，苷類(lèi)（二苯乙烯苷、蒽醌苷）成分含量顯著(zhù)減少，與生何首烏相比，九蒸九曬何首烏中二苯乙烯苷含量減少了約44%，蒽醌苷類(lèi)成分含量減少了約41%；藥典法制何首烏中二苯乙烯苷含量減少了約69%，蒽醌苷類(lèi)成分含量減少了約85%；而5-羥甲基糠醛僅在藥典法制何首烏飲片中檢出，平均質(zhì)量分數為0.506 1 mg/g。
2.3基于電子眼技術(shù)的顏色分析 電子眼采用的色彩系統中L*代表明度指數，a*（紅-綠軸）、b*（黃-藍軸）代表顏色對立維度。對于樣品1、2，ΔL*＝L1*－L2*，為正值時(shí)樣品1顏色偏淺，為負值時(shí)樣品1顏色偏深。Δa*＝a1*－a2*，為正值時(shí)樣品1顏色偏紅，為負值時(shí)樣品1顏色偏綠。Δb*＝b1*－b2*，為正值時(shí)樣品1顏色偏黃，為負值時(shí)樣品1顏色偏藍。樣品顏色可用色度值（Eab*）表示，計算公式為Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2。2個(gè)樣品之間的色差為ΔEab，計算公式為ΔEab＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2，色差值與人眼感覺(jué)色差程度的關(guān)系見(jiàn)表2。 
2.3.1 視覺(jué)分析儀參數設置及供試品前處理 開(kāi)啟IRIS視覺(jué)分析儀，預熱15 min，待指示燈顯示綠燈后，校準儀器鏡頭的曝光度和焦距，使用24色色彩校正板對儀器進(jìn)行校準。校準完成后設置照明模式為頂部及底部照明，拍照模式為單一快照。取適量何首烏供試品粉末（過(guò)40目篩）于扁形稱(chēng)量瓶中，壓平，置于儀器測量白板上，變換位置，平行拍照3次，記錄樣品粉末色號及比例，計算樣品色度空間參數L*、a*、b*值、樣品色度值（Eab*值）及各樣品間的ΔEab值。 2.3.2何首烏不同飲片顏色比較 觀(guān)察各樣品顏色，可見(jiàn)何首烏不同飲片顏色差異明顯，結果見(jiàn)圖2。何首烏不同飲片樣品色度值比較見(jiàn)表3。經(jīng)電子眼測定，九蒸九曬何首烏與生何首烏的ΔEab＞6.0，顏色色差感覺(jué)很明顯，兩者ΔL*為負，Δa*為正，Δb*為負；藥典法制何首烏與生何首烏的ΔEab＞6.0，顏色色差感覺(jué)很明顯，兩者ΔL*為負，Δa*為正，Δb*為負，說(shuō)明經(jīng)九蒸九曬及藥典法炮制后何首烏飲片顏色均變深變紅變藍；藥典法制何首烏與九蒸九曬何首烏的ΔL*為負，Δa*為正，Δb*為負，說(shuō)明藥典法制何首烏飲片較九蒸九曬何首烏飲片顏色變化程度更深。 
2.4 數據分析 2.4.1 含量測定數據分析 將何首烏不同飲片主要成分含量數據導入SIMCA 14.1進(jìn)行系統聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）與無(wú)監督的主成分分析（principal component analysis，PCA），觀(guān)察何首烏不同飲片間聚類(lèi)與自然聚集，結果見(jiàn)圖3、4。HCA結果顯示，何首烏不同飲片可各自聚類(lèi)，當分類(lèi)距離大于15時(shí)，3種飲片聚為2類(lèi)，生何首烏聚為一類(lèi)，九蒸九曬何首烏與藥典法制何首烏聚為一類(lèi)。PCA結果顯示，PC1和PC2的貢獻率分別為81.60%和17.50%，累積貢獻率達99.10%，說(shuō)明該數據能較好反應何首烏不同飲片的整體信息。何首烏不同飲片各自聚集，可分為3類(lèi)，生何首烏集中分布在III象限，九蒸九曬何首烏集中分布在I象限，藥典法制何首烏集中分布在IV象限。
2.4.2 電子眼測定數據分析 將何首烏不同飲片色度值數據導入SIMCA 14.1進(jìn)行HCA與PCA，觀(guān)察何首烏不同飲片間聚類(lèi)與自然聚集，結果見(jiàn)圖5、6。HCA結果顯示，何首烏不同飲片可各自聚類(lèi)，當分類(lèi)距離為10時(shí)，3種飲片聚為2類(lèi)，生何首烏聚為一類(lèi)，九蒸九曬何首烏與藥典法制何首烏聚為一類(lèi)。PCA結果顯示，PC1和PC2的貢獻率分別為99.60%和0.33%，累積貢獻率達99.93%，說(shuō)明該數據能較好反映何烏不同飲片的整體信息。何首烏不同飲片各自聚集，可分為3類(lèi)，生何首烏集中分布在I象限，九蒸九曬何首烏集中分布在III象限，藥典法制何首烏集中分布在II象限。
2.5何首烏不同飲片主要成分含量與顏色變化的相關(guān)性分析 普通多元線(xiàn)性回歸建模前提必須滿(mǎn)足樣本數量較多，變量數量較少，且變量之間無(wú)多重共線(xiàn)性的條件才具有合理性，若數據不能完全滿(mǎn)足上述條件，則模型無(wú)法使用。本實(shí)驗中變量較多，且成分之間存在多重共線(xiàn)性的問(wèn)題，因此無(wú)法采用普通多元線(xiàn)性回歸模型。偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLS）法可以提取出對因變量解釋最強、影響最大的綜合變量，辨識系統中的信息與噪聲，因此很大程度上能夠克服變量之間的多重相關(guān)性在回歸建模中的不良作用，可以有效地解決在普通多元線(xiàn)性回歸的建模過(guò)程中因自變量之間存在多重相關(guān)性而影響參數估計的準確性和合理性的問(wèn)題，縮小模型誤差，增強模型的穩健性[19]。 在PLS回歸模型中，R2X和R2Y分別表示模型對自變量和因變量的解釋能力，Q2表示模型的預測能力，通常認為上述3個(gè)指標以大于0.5為宜，越接近1表示模型擬合數據效果越好；自變量在解釋因變量時(shí)作用的重要性可以用變量投影重要性指標（VIP）來(lái)度量，通常認為VIP值大于1的自變量對因變量有顯著(zhù)影響。 將測得的成分含量數據與顏色指標L*、a*、b*值導入SIMCA 14.1軟件，以成分含量作為自變量，各顏色指標作為因變量，建立PLS模型。建立的PLS模型R2X＝0.991，R2Y＝0.988，Q2＝0.981，說(shuō)明建立的模型穩定且預測能力較強。根據VIP值＞1的原則，可發(fā)現沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚對何首烏的各顏色指標有顯著(zhù)影響，5-羥甲基糠醛、大黃素甲醚-8-O- β-D-葡萄糖苷、大黃素對何首烏顏色無(wú)顯著(zhù)影響。見(jiàn)圖7。 根據PLS模型的回歸系數（表4），沒(méi)食子酸、大黃素、大黃素甲醚的含量與L*、b*值呈負相關(guān)，與a*值呈正相關(guān)；5-羥甲基糠醛的含量與L*值呈負相關(guān)，與a*、b*值呈正相關(guān)；二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量與L*、b*值呈正相關(guān)，與a*值呈負相關(guān)。提示沒(méi)食子酸、大黃素、大黃素甲醚這3種成分與何首烏飲片變深、變紅、變藍有關(guān)，與炮制后何首烏飲片顏色總體變化相一致；二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷這3種成分與何首烏飲片變淺、變綠、變黃有關(guān)，與炮制后何首烏飲片顏色總體變化相反。
3 討論 本實(shí)驗分別采用50%、80%、100%甲醇及50%、80%、100%乙醇作為提取溶劑考察對各成分含量的影響，結果表明以80%甲醇提取各成分含量較高且峰形良好，因此選用80%甲醇作為提取溶劑；分別比較了超聲15、30、45、60 min，回流30、60、90、120 min，冷浸4、8、12 h對各成分含量的影響，結果表明回流對各成分的提取率較高，且不同回流時(shí)間下提取率差異不大，因此選用回流30 min作為提取方法。通過(guò)對提取方法的考察，最終確定本實(shí)驗供試品溶液的制備方法為80%甲醇回流提取30 min。本實(shí)驗通過(guò)對古代經(jīng)典九蒸九曬炮制法與藥典法制何首烏飲片的對比研究，發(fā)現二者主要成分含量及顏色的總體變化趨勢較為相似，但有程度上的差異，且二者成分組成也有明顯的區別。 何首烏中含有鞣質(zhì)類(lèi)成分和具有沒(méi)食子酰基的苷類(lèi)成分[20-21]，在炮制過(guò)程中上述成分受熱分解后轉化為沒(méi)食子酸[22-23]，故炮制后沒(méi)食子酸量顯著(zhù)增加。二苯乙烯和蒽醌類(lèi)成分是何首烏中的主要有效成分，同時(shí)也是其肝毒性的主要物質(zhì)基礎[24-25]，二者的含量及結構與何首烏肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)，可通過(guò)控制合理的炮制工藝，將上述2類(lèi)成分的含量控制在安全有效的范圍內，以便提高用藥的安全性[26]。二苯乙烯及蒽醌類(lèi)成分對光、熱具有不穩定性[27-28]，在加熱炮制過(guò)程中會(huì )發(fā)生分解，在反復蒸、曬過(guò)程中會(huì )發(fā)生光環(huán)加成反應[29]，因此，采用連續加熱方式的藥典法制何首烏比采用間隔蒸、曬方式的九蒸九曬何首烏中上述2類(lèi)成分含量降低的幅度更為顯著(zhù)。 5-羥甲基糠醛既是Maillard反應產(chǎn)物，又可通過(guò)糖的直接降解或脫水產(chǎn)生[30-31]，溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(cháng)均可導致其含量增加[32]，因此5-羥甲基糠醛成為很多采用加熱炮制（炒制、蒸制、燉制等）中藥飲片的特征性標志物。何首烏中含有的糖類(lèi)成分以及炮制過(guò)程中苷類(lèi)分解產(chǎn)生的糖類(lèi)成分均可與氨基成分發(fā)生Maillard反應，從而生成5-羥甲基糠醛。本實(shí)驗中僅在藥典法制何首烏飲片中檢測到了5-羥甲基糠醛，而九蒸九曬何首烏飲片中未檢出該成分，說(shuō)明5-羥甲基糠醛的產(chǎn)生與炮制工藝密切相關(guān)。藥典法采用液體輔料連續燉制，而九蒸九曬法采用固體輔料間隔蒸、曬，何首烏飲片在兩種方法炮制過(guò)程中的受熱程度、加熱方式、加熱時(shí)間及光照等都有著(zhù)顯著(zhù)差異，且5-羥甲基糠醛性質(zhì)活潑，對溫度、濕度、光、空氣較為敏感[33]，可進(jìn)一步分解為乙酰丙酸和甲酸或是聚合[34]，推測在九蒸九曬何首烏中由于“曬”這一工藝環(huán)節，導致已生成的5-羥甲基糠醛分解，因此未能檢出。 5-羥甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化等作用，同時(shí)，該成分還易導致結腸小囊異常生長(cháng)（aberrant crypt foci，ACF），對人體橫紋肌和內臟也具有毒副作用[34]。此外，不同炮制方法對何首烏飲片中主要成分的量比關(guān)系也有顯著(zhù)的影響，九蒸九曬制何首烏中各類(lèi)成分的量比關(guān)系約為沒(méi)食子酸-二苯乙烯苷-蒽醌苷-蒽醌苷元（1∶25∶2∶10），而藥典法制何首烏中上述成分的量比關(guān)系約為1∶11∶0.3∶7，各成分間量比關(guān)系差異顯著(zhù)，因此，古今2種方法制備的何首烏飲片主要藥效物質(zhì)組成及量比關(guān)系的顯著(zhù)差異極有可能會(huì )成為導致其藥效及毒性差異的主要原因，后續將通過(guò)相關(guān)藥效學(xué)實(shí)驗進(jìn)行系統的研究。 電子眼測定結果表明，不同炮制方法對何首烏飲片顏色的影響也不盡相同。顏色的變化主要源于2個(gè)方面，一方面是何首烏在炮制過(guò)程中自身化學(xué)成分在高溫、高濕的條件下發(fā)生褐變反應，生成褐色聚合物，導致飲片顏色加深；另一方面是源于炮制過(guò)程中輔料的間接影響，藥典法應用的液體輔料黑豆汁中含有大量色素類(lèi)成分[35]，對何首烏飲片起賦色作用，導致其飲片顏色加深，而九蒸九曬方法中應用的是固體輔料黑豆，對何首烏飲片幾乎無(wú)賦色作用，由此形成了兩種方法炮制的何首烏飲片顏色上的差異。 為了進(jìn)一步分析何首烏飲片物質(zhì)基礎與顏色的相關(guān)性，本實(shí)驗對測定的7種主要化學(xué)成分含量與顏色特征值進(jìn)行了多元統計分析，HCA和PCA結果顯示古今方法炮制的何首烏飲片可各自聚為一類(lèi)，且與生何首烏相比，古、今方法炮制的何首烏飲片可聚為一類(lèi)，進(jìn)一步驗證了九蒸九曬法與藥典法制何首烏飲片的個(gè)性特征及共性規律。沒(méi)食子酸及蒽醌苷元含量與何首烏飲片顏色變深呈正相關(guān)，二苯乙烯苷及蒽醌苷含量與何首烏飲片顏色變深呈負相關(guān)。因此，可通過(guò)快速無(wú)損的顏色檢測，實(shí)現對何首烏飲片炮制工藝的控制及飲片質(zhì)量的客觀(guān)評價(jià)。本實(shí)驗從物質(zhì)基礎與顏色變化的相關(guān)性角度對古代經(jīng)典九蒸九曬炮制方法與現代藥典收載的制何首烏炮制方法進(jìn)行了對比研究，結果顯示，2種方法炮制的制何首烏飲片雖然在外觀(guān)性狀的主觀(guān)評價(jià)上具有較高的相似性，但通過(guò)現代智能感官分析技術(shù)的客觀(guān)表征和主要藥效物質(zhì)的分析，可以初步證明古今2種方法炮制的制何首烏飲片是2種獨立的藥效載體，傳統經(jīng)典炮制方法存在的合理性不僅有其悠久臨床應用歷史的佐證，也有現代科學(xué)技術(shù)對其科學(xué)內涵的闡釋?zhuān)卟痪哂刑娲浴＿M(jìn)一步系統開(kāi)展2種炮制方法的藥效學(xué)研究，將為全面分析何首烏古今炮制方法，解決何首烏炮制工藝不規范、質(zhì)量不穩定等問(wèn)題，提高何首烏臨床應用的安全性和有效性提供新的依據。
來(lái) 源：于 淼，代 悅，劉濤濤，肖永慶，李 麗．基于物質(zhì)基礎與顏色變化相關(guān)性分析的制何首烏古今炮制方法探討 [J]. 中草藥, 2023, 54(11):3480-3488.轉載請注明來(lái)源。
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