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低鹽洗澡泡菜菌落結構及其風(fēng)味研究
發(fā)布日期:2023-08-02
        四川傳統洗澡泡菜是餐飲行業(yè)中常用的一種特殊泡 。其做法是將白蘿卜(卷心菜、紅皮蘿卜等)刀工成型后采用食鹽干腌, 脫掉多余水分, 放入泡菜壇, 倒入復配的泡菜水, 泡制 2~3 d 而成。蔬菜在微生物的作用下進(jìn)行微發(fā)酵, 其特殊的咸酸味以及爽脆口感的形成與壇中微生物菌群結構等因素密切相關(guān),本實(shí)驗旨在優(yōu)化低鈉咸味劑制備四川傳統洗澡泡菜的最佳工藝配方以及四川傳統洗澡泡菜菌落結構、風(fēng)味特征, 了解低鈉咸味劑對四川傳統洗澡泡 菜菌落結構、風(fēng)味特征的影響, 為低鈉咸味劑在四川傳統洗澡泡菜中的應用提供數據支持。
        材料與方法
        材料
        低鈉咸味劑(天津春發(fā)生物科技有限公司); 花椒、白蘿卜(四川省成都龍泉永輝超市); 廣樂(lè )野山椒(四川廣樂(lè )食品有限公司); 白砂糖(福建好日子食品有限公司); 白醋(千味業(yè)股份有限公司); 二鍋頭(北京順心農業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠(chǎng)); 食鹽(四川久大制鹽有限公司)DNA 提取試劑盒(南京集思慧遠生物科技有限公司);MiSeq Reagent Kit V3 基因測序試劑盒(美國 Illumina 圣地亞哥公司)
        儀器
        FlavourSpec@風(fēng)味分析儀(德國 G.A.S 公司); α-ASTREE電子舌(法國 Alpha MOS 公司); MiSeq 測序儀(美國 Illumina圣地亞哥公司); ML204 萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒-托利多國際貿易有限公司); GZ-150-S 型生化培養箱(韶關(guān)市廣智科技有限公司); MXT-5 (15 m×0.53 mm, 0.5 μm)色譜柱(RESTEK 公司); KQ5200E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)
        
        洗澡泡菜的制備
        在前期的單因素實(shí)驗中發(fā)現低鈉咸味劑替代率、泡制溫度、泡制時(shí)間 3 個(gè)因素對洗澡泡菜風(fēng)味的影響較大, 此基礎上, 設計了 3 因素 3 水平的正交實(shí)驗, 以感官評分為依據, 篩選出評分最高的 3 個(gè)處理組, 進(jìn)一步優(yōu)化其工藝配方。
        (1)工藝流程
        原料預處理干腌脫鹽裝入泡菜壇倒入復配的泡菜水恒溫泡制。
        (2)工藝要點(diǎn)
        原料預處理: 將白蘿卜去皮, 切成半徑長(cháng) 3 cm, 0.5 cm 的扇形薄片。干腌: 稱(chēng)取 500 g 的白蘿卜用 30 g 鹽干腌 15 min。脫鹽: 洗去白蘿卜上多余食鹽, 瀝干。
        泡菜水的配制: 純凈水 800 g、野山椒 35 g、野山椒20 mL、味精 5 g、白糖 40 g、花椒 2 g、白酒 15 g、白25 g, 低鈉咸味劑替代量見(jiàn)表 1, 攪拌均勻后倒入泡菜, 泡菜水淹沒(méi)白蘿卜。
        1 樣品處理條件表
表1
        : 對照組食鹽含量 5.38%, 
        DNA 提取及 16S rDNA 分析
        提取洗澡泡菜中微生物的總DNA, 對微生物 DNA 的濃度、純度以及完整度進(jìn)行檢測和擴增測序, 用特定引物對微生物的16S V4~V5 區域進(jìn)行擴增, 得到的增序片段采用 Illumina Novaseq6000 測序, 序得到的序列進(jìn)行 16S rDNA 分析。
         洗澡泡菜氣相色譜-離子遷移色譜測定
        對陽(yáng)性對照組(四川傳統洗澡泡)和低鈉咸味劑處理組進(jìn)行氣相色譜-離子遷移色譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)測。取 4.00 g 樣品置于 20 mL 頂空瓶, 自動(dòng)頂空進(jìn)樣(進(jìn)樣針溫度 80℃、孵育溫度 60℃、孵化轉速 500 r/min), GC-IMS 單元[色譜柱型號為 MXT-5 (15 m×0.53 mm,0.5 μm)、柱溫 60℃、載氣 N2、漂移管溫度 45℃、進(jìn)樣體500 μL、孵育時(shí)間 20 min], 運行 30 min
        洗澡泡菜電子舌檢測
        10 g 洗澡泡菜, 制備 20 mL 研磨液, 將研磨液移入100 mL 容量瓶定容到 100 mL, 用超聲波浸提 30 min ,80 mL 上清液移至專(zhuān)用燒杯進(jìn)行電子舌檢測。
        結果與分析
        洗澡泡菜中細菌和真菌的 Alpha 多樣性分析
        洗澡泡菜中細菌的 Alpha 多樣性分析
        本研究的對照組與 3 個(gè)處理組的 Goods coverage 指數接近于 1(或等于 1), 說(shuō)明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種, 本研究數據有效。Alpha 多樣性主要是指樣本中群落的多樣性, Observed features 指數和 Chao1 指數反映樣品中群落的豐富度(species richness), 即指群落中物種的數量, 數值越大物種數越多。表 2 可知, JY2 Chao1 (107.50)Observed features (105.00)最高, JY2 的細菌物種最豐富, JY1JY3 Chao1 值、Observed features 均最低, 故其細菌物種最少。其原因可能是適當的食鹽濃度、泡制溫度有利于細菌菌落在 JY2 中大量繁殖, 使其細菌物種最為豐富; 高濃度的食鹽、過(guò)低或過(guò)高的泡制溫度抑制了細菌菌落在 JY1 JY3 中生長(cháng)繁殖, 導致 JY1 JY3 的細菌物種數最少。結果提示低鈉咸味劑替代率、泡制溫度會(huì )影響細菌菌落的生長(cháng), 導致洗澡泡菜內細菌群落結構發(fā)生改變。Simpson 指數反映了物種分配均勻性和多樣性, 從表 2 可知, JY2 Simpson 指數以外, JY1 Simpson 指數與對照組一致(均為 0.89), JY3 Simpson (0.90)大于對照組, 進(jìn)一步說(shuō)明了低鈉咸味劑替代率、泡制溫度對洗澡泡菜中細菌的多樣性存在影響。
2 樣品中細菌 Alpha 多樣性指數和種群豐富度
表2
        洗澡泡菜中真菌的 Alpha 多樣性分析
        由表 3 可知, 各組的 Simpson 指數均接近 1, 說(shuō)明其均勻度高; Goods coverage 的值均接近 1, 說(shuō)明測序深度都基本覆蓋了所有物種, 本次實(shí)驗是有效的。真菌的 Chao1指數和 Observed features 指數都高于細菌, 說(shuō)明洗澡泡菜中的真菌物種數目較細菌豐富, JY2 Chao1 (507.4)Observed features (503)值最高, 說(shuō)明 JY2 的真菌物種數最, JY3 Chao1 (260.0)Observed features (260)值最低,JY3 的真菌物種數最少, JY1 和對照組的 Chao1 值和Observed features 值最接近, JY1 與對照組的真菌物種數最為相近。綜上, JY1 在真菌物種的豐富度、分配均勻度以及物種的多樣性程度與對照組的相似度最高。
  表 3 樣品中真菌 Alpha 多樣性指數和種群豐富度
         表3
        洗澡泡菜中真菌和細菌的物種注釋
        洗澡泡菜中細菌的物種注釋
        對相對豐度前 20 的物種進(jìn)行聚類(lèi)分析, 如圖 1 所示,細菌菌群在屬水平上相對豐度最高的是乳桿菌屬, 對照組3 個(gè)處理組的相對豐度均達 51%以上, 其中 JY2 乳桿菌屬含量最高(68.92%), 其次是 JY1 (53.72%)JY3 (51.67%), 照組含量最低(51.60%), 乳桿菌屬是泡菜的優(yōu)勢菌群JY2 的高乳桿菌屬含量與其適宜的低鈉咸味劑替代率30%(食鹽含量)有關(guān), 即適宜的食鹽濃度有利于乳桿菌屬的生長(cháng)。乳桿菌屬含量的高低與泡菜風(fēng)味的形成息息相關(guān), 泡菜中乳桿菌屬利用糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、有機酸、氨基酸產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì), 賦予泡菜特殊風(fēng)味。明串珠菌屬在泡菜泡制過(guò)程中利用葡萄糖進(jìn)行異性乳酸發(fā)酵產(chǎn)生甘露醇,賦予泡菜清爽的甜味。JY3 中明串珠菌屬相對豐度最高(21.19%), 其次是對照組(7.83%)JY1 (4.03%), JY2 最低(2.80%)。根據韓亞楠等[20]研究發(fā)現, 明串珠菌的最適生長(cháng)溫度是 32~38℃, 且具有較強的耐鹽性, 其原因可能與明串珠菌屬具有耐高鹽和喜高溫的特性有關(guān), 故對照組和JY3 中明串珠菌屬的相對豐度高于 JY1 JY2。其他各類(lèi)細菌菌屬的相對豐度在各組洗澡泡菜中均不超過(guò) 1%。一方面是乳酸桿菌屬成為優(yōu)勢菌后對其他微生物生長(cháng)的抑制作用,另外可能是食鹽濃度、泡制溫度不適于其他細菌菌屬生長(cháng),如普雷沃泰勒菌屬(Prevotella)生長(cháng)的最適溫度為 37℃且在鹽濃度過(guò)高的環(huán)境下難以生存, 但其能利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和琥珀酸以及少量的乳酸, 豐富泡菜風(fēng)味。
圖1
        1 細菌屬水平前 20 名相對豐度柱狀圖
        洗澡泡菜中真菌的物種注釋
        由圖 2 可知, 除未分類(lèi)真菌外, 對照組中漆斑霉菌屬(Myrothecium, 4.91%)相對豐度最高, 漆斑霉菌屬的適宜生長(cháng)溫度為 28℃且嗜鹽, 此外, 漆斑霉屬產(chǎn)生的漆酶有利于洗澡泡菜中醛類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等揮發(fā)性香氣物質(zhì)的形成3 個(gè)處理組中毛殼菌(Chaetomium)相對豐度均是最高; JY1中含有脈孢菌(Neurospora, 3.74%)、赤霉菌(Gibberella,3.45%); JY2 中含有赤霉菌(Gibberella, 28.57%)、脈孢菌(Neurospora, 4.96%); JY3 中含有赤霉菌 (Gibberella,3.08%)、被孢霉(Mortieralla, 1.63%)。綜上, 3 個(gè)處理組中毛殼菌(Chaetomium)為第一優(yōu)勢真菌屬, 其中, JY2 的相對豐度最高(37.80%), JY1 次之(5.72%), JY3 最少(5.62%)。姜研究發(fā)現, 毛殼菌生長(cháng)繁殖的適宜溫度應低于 25℃且食鹽含量過(guò)多會(huì )抑制其生長(cháng), 由此推測 JY2 中毛殼菌屬相對豐度最高的原因是其泡制溫度(25℃)適宜且食鹽含量最低(28 g), JY3 中毛殼菌屬相對豐度最低是因為其泡制溫度稍高(30℃)且食鹽含量較高(36 g)。毛殼菌能供給泡菜泡制過(guò)程所需的酶類(lèi), 乳酸在酶的作用下生成乳酸乙酯, 成泡菜的特殊風(fēng)味
圖2
2 洗澡泡菜真菌在屬水平物種分類(lèi)熱圖
        洗澡泡菜中細菌和真菌 β 多樣性分析
        洗澡泡菜中細菌 β 多樣性分析
        Bray curtis 距離常用來(lái)反映群落之間差異性, Braycurtis 數值越小, 菌落結構相似度越高, 見(jiàn)圖 3。對照組與JY3 Bray curtis 值最小(0.391), JY2 最大(0.948), JY3在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY2與對照組差異最大。歐雪等報道在含鹽量較高的泡菜組別中, 鹽對菌落的影響不顯著(zhù), 故推測 JY3 與對照組在細菌結構上相似的原因是JY3食鹽含量(36 g)與對照組(40 g)最接近;JY2 食鹽含量(28 g)與對照組差異較大, 這與呂家研究結果一致, 提示食鹽含量的變化對泡菜菌落結構影響較大。本研究中, JY2 泡制溫度(25℃)同對照組相同, JY3泡制溫度 30℃, JY3 在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, 由此推測 5℃的泡制溫度差異可能對泡菜菌落結構影響不大。
圖3
3 洗澡泡菜中的細菌 β 多樣性距離熱圖
        洗澡泡菜真菌 β 多樣性分析
        由圖 4 可知, 對照組與 JY1 Bray curtis 值最小(0.148), JY3 最大(0.263), JY1 在真菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY3 與對照組差異最大, 這與 2.2.2 研究結果一致。
圖4
        4 洗澡泡菜中的真菌 β 多樣性距離熱圖
        洗澡泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析
        洗澡泡菜中揮發(fā)性化合物的分析
        洗澡泡菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由兩部分組成: 部分來(lái)自蘿卜、香辛料、調味料本身氣味, 另一部分是蘿卜經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。由表 4 可知, 照組與 3 個(gè)處理組中共檢出 55 種揮發(fā)性物質(zhì), 其中酚類(lèi) 5種、醇類(lèi) 12 種、酯類(lèi) 12 種、酮類(lèi) 8 種、醛類(lèi) 3 種、酸類(lèi)3 種、吡嗪類(lèi) 2 種、烴類(lèi) 4 種、醚類(lèi) 1 種、雜環(huán)類(lèi) 4 種、含氮化合物 1 種。湯艷燕等[28]采用 GC-MS 檢測了四川傳統泡蘿卜中的揮發(fā)性物質(zhì), 共檢出 39 , 其中酯類(lèi) 8 種、烷烴類(lèi) 7 種、醛類(lèi) 4 種、醇類(lèi) 3 種、芳烴類(lèi) 2 , 硫類(lèi)、烯烴類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、醚類(lèi)各 1 種。洗澡泡菜中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)較傳統泡菜多出 16 , 特別是對泡菜風(fēng)味貢獻較大的醇類(lèi)、酯類(lèi)。這是可能是因為傳統泡蘿卜泡制使用的食鹽量多, 其微生物數量減少, 風(fēng)味物質(zhì)減少JY3檢出揮發(fā)性物質(zhì)最多(53 ), 其次是 JY2 (44 )、對照組(44 ), JY1 最少(41 ), 對照組與 JY2 在檢出揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)數上最接近。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與泡菜中微生物密切相關(guān), 2.1.1(細菌 Alpha 多樣性分析)JY2 的細菌物種最豐, JY1JY3 最少; 2.2.1(細菌的物種注釋)JY2 乳桿菌屬含量最高, 對照組含量最低。細菌物種豐富、乳桿菌屬含量高, 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)應越多, JY3 檢出揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)是最多的, 這可能與菌群中產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的菌種種類(lèi)及數量有關(guān), 也可能與菌群處于的生長(cháng)階段有關(guān)。對照組與 3 個(gè)處理組中均檢出的揮發(fā)性物質(zhì)有 38 , 與對照組比較, 檢出相同揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)最多的是 JY1 (41 ),這可能與 JY1 的乳桿菌屬含量與明串珠菌屬含量與對照組相似度最高有關(guān), 這與 YANG [32]的研究一致。
         洗澡泡菜 GC-IMS 指紋圖譜分析
4 洗澡泡菜中的揮發(fā)性化合物
表4

原表
        如圖 5 所示, 每列亮點(diǎn)均表示同一保留時(shí)間及漂移時(shí)間的揮發(fā)性化合物的信號峰, 亮點(diǎn)的顏色與范圍代表?yè)]發(fā)性化合物含量, 顏色越深、范圍越大, 表明該揮發(fā)性化合物的相對含量越高。由圖 5 可知, 對照組與 3 個(gè)處理組在特征風(fēng)味物質(zhì)上的差異較大, 對照組的特征風(fēng)味物質(zhì)是 2-呋喃乙醇; JY1 是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、異戊酸; JY3 3-仲丁基-2-甲氧基吡嗪、醇、芳樟醇、甲基麥芽酚、苯乙酮、羅勒烯、2,6-二氯酚、松油烯-4-醇、2,4-二氯苯酚。唐麗等報道四川傳統泡菜的特征風(fēng)味物質(zhì)是乙酸、丁酸、乙酸乙酯和 2-乙基-1-己醇, 與對照組和 3 個(gè)處理組均不同, 因其是傳統發(fā)酵泡菜, 且使用成熟泡菜的發(fā)酵液進(jìn)行泡制, 泡制時(shí)間較長(cháng)(5 個(gè)月), 故其特征風(fēng)味物質(zhì)與本實(shí)驗樣品組差異較大。2.3(細菌和真菌 β 多樣性分析)JY2 在細菌菌落結構上與對照組差異最大; JY3 在真菌菌落結構上與對照組差異最大。菌落結構的差異會(huì )影響特征風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)。圖5 可知, JY3 中的醇類(lèi)物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)較對照組高, 可能與JY3 中的明串珠菌含量高有關(guān)[34]; JY2 中乳桿菌屬的含量最高, 乳桿菌有利于乳酸、乙酸、酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)生成,可進(jìn)一步形成乙酸丁酯。
圖5
5 洗澡泡菜中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜
        洗澡泡菜電子舌分析
        判別因子分析(discriminant factorial analysis, DFA)將電子舌的數據重新組合, 縮小組內的變量差距, 并且擴大組間的變量差距, 從而達到區分各種樣品的目的的一種分析方法。將電子舌采集到的響應值數據進(jìn)行 DFA 分析,由圖 6 可知前 2 個(gè)判別因子的貢獻率分別為 79.804%19.191%, 累計貢獻率達到 98.994%(超過(guò) 95%), 說(shuō)明 2 主成分包括了對照組和各個(gè)處理組的絕大部分的信息。在三維圖中, 組內的每個(gè)數據點(diǎn)之間的距離很小, 可以很好地聚集在一起, 各組之間數據點(diǎn)非常明顯地分布在三維圖的各個(gè)角落, 由此可以判定, 電子舌能識別出不同處理組洗澡泡菜。JY1 與對照組距離最近, JY3 與對照組距離最遠,說(shuō)明 JY1 與對照組在滋味上的相似度最高, JY3 與對照組差異最大, 這與低鈉咸味劑替代率、泡制溫度有關(guān)。低鈉咸味劑中含有美拉德反應咸味肽、非鈉型咸味物質(zhì)、果蔬粉或果蔬提取物、酸味粉末物質(zhì)和鮮味物質(zhì), 能提供咸味、酸味、鮮味, 對泡菜滋味影響較大。JY3 的低鈉咸味劑替代率(10%)最少, 但其泡制溫度最高30℃), JY1 的低鈉咸味劑替代率為 20%, 但泡制溫度最低(20℃), 在相同的泡制時(shí)間下, 溫度越低, 食鹽、低鈉咸味劑擴散進(jìn)入蘿卜的速度越慢, JY1 與對照組在滋味上的相似度最高。
圖6
6 洗澡泡菜電子舌判別因子分析三維圖

        
        與傳統洗澡泡菜的菌落結構、風(fēng)味差異最小的低鹽洗澡泡菜是JY1, 即低鹽洗澡泡菜的最佳工藝配方是泡制溫度20℃,泡制時(shí)間 48 h, 低鈉咸味劑替代量 20%(食鹽用量 32 g)
        四川傳統洗澡泡菜的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、漆斑霉菌屬, 低鹽洗澡泡菜(3 個(gè)處理組)的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、毛殼菌屬。洗澡泡菜中的真菌物種數目比細菌多, JY2 中真菌物種數、細菌物種數均最豐富。JY3 在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY2 與對照組差異最大。JY1 在真菌菌落結構上與對照組相似度最, JY3 與對照組差異最大。可見(jiàn), 低鈉咸味劑對洗澡泡菜菌落結構存在一定影響。
        四川傳統洗澡泡菜中檢出揮發(fā)性物質(zhì) 44 , 其特征風(fēng)味物質(zhì)是 2-呋喃乙醇; JY2 與其在揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)上差異最小, JY1 與其共有的揮發(fā)性物質(zhì)最多。JY1 中的特征風(fēng)味物質(zhì)是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、異戊酸; JY3 醇、芳樟醇、甲基麥芽酚, 與對照組差異較大。JY1 與對照組在滋味上的相似度最高。綜合菌落結構、揮發(fā)性物質(zhì)以及滋味, JY1 與對照組的品質(zhì)最接近。低鈉咸味劑量對洗澡泡菜的風(fēng)味是有顯著(zhù)影響的, 本研究結果為低鈉咸味劑在洗澡泡菜中的使用提供了理論支撐。
        參考文獻:肖嵐,廖佑琴,王新程等.低鹽洗澡泡菜菌落結構及其風(fēng)味研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2023,14(10):22-30.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2023.10.012.
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